在地球的深海熱泉、濕地，或者動物腸道和沉積物等環(huán)境中，生活著一群“無氧居民”——厭氧微生物。他們能分解有機廢物、產(chǎn)生甲烷等可再生能源，還能參與溫室氣體的生成和消減——從污水處理廠到畜禽養(yǎng)殖、從沼氣利用到腸道健康，都離不開它們。
然而，人類想要分離得到有益的厭氧微生物，卻很困難——它們異常難養(yǎng)。
厭氧菌的賽跑：誰能跑到終點？微生物分離就像賽跑：紅色桿狀是目標微生物，其他顏色的是“競爭對手”。目標菌在不同“賽道”上可能占據(jù)優(yōu)勢、緩慢勝出。受訪者供圖
近日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部成都沼氣科學研究所（以下簡稱沼科所）厭氧微生物創(chuàng)新團聯(lián)合荷蘭瓦赫寧根大學團隊找到了新的辦法。他們利用厭氧微生物的生長曲線當“指揮棒”，利用自創(chuàng)的“雞尾酒法”定向分離產(chǎn)甲烷古菌。相關研究成果在線發(fā)表于《微生物趨勢》（Trends in Microbiology）和《自然—試驗流程》（Nature Protocols）。
唯厭氧微生物難養(yǎng)也
雖然我們不能用肉眼看見它們，但厭氧微生物是全球碳、氮、硫循環(huán)的重要驅(qū)動者，它們與人類的關系非常密切。
論文第一作者、沼科所在讀博士生巫可佳告訴《中國科學報》，這些“無氧居民”對生活條件要求極高——一點氧氣都不能碰，常常需要特定的溫度、酸堿度、營養(yǎng)條件才能進行生長和生存。
它們大多生活在濕地、深海、腸道、熱泉等地下缺氧環(huán)境中，無法脫離地下缺氧環(huán)境，就好像一群“隱居高手”。生長緩慢、數(shù)量不多，有些還離不開特定“伙伴”。這些厭氧菌需要與其他微生物互相交換營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物，通過共培養(yǎng)或者共生才能生存，就像“搭檔關系”，缺了對方就活不下去。
這種生存方式使得它們在實驗室環(huán)境中非常難以存活，一旦被請進實驗室，就常常悄然消失。
如果想要把它們培養(yǎng)成純菌狀態(tài)，就更難了。
論文通訊作者、沼科所研究員承磊在接受《中國科學報》采訪時說，獲得純培養(yǎng)物，是研究新型微生物的生理功能、代謝功能、生態(tài)功能的資源基礎，以及如何利用它們在清潔能源生產(chǎn)、污染治理、健康等方面的能力。
傳統(tǒng)的分離方法像是舉辦一場“短跑賽”，要求目標厭氧菌一開始就具備絕對生長優(yōu)勢，一步到位打敗所有競爭者，這讓許多“慢熱型選手”始終無緣亮相。
承磊解釋說，這是因為厭氧菌通常生長慢，生長條件苛刻，容易被“快生長”的非目標菌淹沒。
2016年，承磊團隊著手從一份2007年取自我國勝利油田的樣本中分離產(chǎn)甲烷古菌，由于這份樣本對“投喂”的甲醇異常敏感，并且能產(chǎn)生甲烷。承磊團隊認為，這里面可能隱藏著新的產(chǎn)甲烷古菌的生存模式。
但是要想搞清楚這里面的厭氧古菌究竟如何產(chǎn)生甲烷，首先要把它從成分復雜的樣本中分離出來。然而，究竟如何讓如此難養(yǎng)的厭氧微生物在實驗室環(huán)境中生存并分離？這成為他們迫切想解決的難題。
生長曲線當“指揮棒”
傳統(tǒng)方法解決不了他們的問題。只能自己想辦法。
“我們在多年分離實驗中發(fā)現(xiàn)，單一方法往往不夠。”承磊說，因為分離過程中既要保證目標菌的生長，同時又要抑制非目標菌，而一個樣品中的非目標菌是多種多樣的，通常單一的方法很難去除復雜的目標菌，因此需要靈活組合多種“配方”——稀釋、限制養(yǎng)料、加抑制劑……像調(diào)制雞尾酒一樣，根據(jù)情況調(diào)整分離策略來逐步去除不同的非目標菌。
巫可佳說，通過定期取樣，用分子生物學方法或者流式細胞計數(shù)等方法監(jiān)測目標菌和其他菌的細胞數(shù)量變化，按時間和細胞數(shù)量變化畫成生長曲線。
他們提出用生長曲線當“指揮棒”，實時觀察目標菌和非目標菌的生長動態(tài)。在不同階段創(chuàng)造條件，讓目標菌占據(jù)“相對優(yōu)勢”，或者讓非目標菌對目標菌的抑制更輕微，一步步“請走”非目標菌，直到目標菌能單獨站上舞臺。
巫可佳解釋說，把難培養(yǎng)微生物的分離過程為多個階段——先摸清目標微生物的生長“喜好”，再通過稀釋、限制養(yǎng)料、精準抑制等手段逐步減少“陪客”，最后只留下目標微生物?！斑@套方法的特別之處在于，不要求目標菌一開始就跑得最快，而是通過階段性調(diào)整，讓它在不同‘賽段’中都能保持相對優(yōu)勢。”
針對不同類型的非目標菌，他們有不同“招數(shù)”：有的改變營養(yǎng)條件（底物、生長刺激因子），有的改變物理化學因子（溫度、pH、鹽濃度等）或者梯度稀釋，有的加抗生素或溶菌酶抑制非目標菌。
“我們第一次用多年摸索的方法成功分離到非廣古菌門的新型產(chǎn)甲烷古菌，并通過分離獲得的菌株解析其生理和代謝機制。”承磊所說的這項工作成果2024年7月發(fā)表在《自然》雜志。
后來，他們總結(jié)和提煉了該團隊十多年厭氧微生物分離經(jīng)驗，形成了“基于生長曲線”和“相對生長優(yōu)勢”的微生物純培養(yǎng)理念。
基于底層邏輯的分離方法
“很開心能用這套方法挖掘出新型的產(chǎn)甲烷古菌?！蔽卓杉颜f，這是基于分離微生物的底層邏輯入手的——如何從一個復雜的群落中獲得目標菌。一個底層的理念可以適用于微生物生長分離的各個階段，不僅適用于厭氧微生物，同時也適用于好養(yǎng)、兼性厭氧等微生物的分離。“期望未來可以幫助到更多的微生物資源的分離?！蔽卓杉颜f。
承磊強調(diào)，此方法的建立受益于測序技術的發(fā)展，這使得人們可以鑒定復雜群落中的目標菌和非目標菌，以達到分離的目的。
《微生物趨勢》論文審稿人說，這篇論文關注了一個長期以來被系統(tǒng)性忽視的重要主題?？茖W界普遍存在偏見，導致大家逐漸形成一種共識：所謂“不可培養(yǎng)”的微生物，是真的無法被培養(yǎng)，或者說付出的努力代價太大，以至于不值得去嘗試?！安豢膳囵B(yǎng)”這個說法本身，就暗示了不可能性，從而加劇了這種不幸的局面。
“雖然宏基因組學在發(fā)現(xiàn)新型微生物方面非常有用，但它在一定程度上也削弱了科學家們繼續(xù)開展更費時、更具智力挑戰(zhàn)性的分離培養(yǎng)研究的動力。更為遺憾的是，學界并沒有充分認識到宏基因組信息與分離培養(yǎng)株生理學之間存在的巨大理解鴻溝?！睂徃迦苏f，這篇論文引起了大家對這些不足的關注，更重要的是，提出了切實可行的實驗思路來彌補這些缺陷。這是一項“極有價值、恰逢其時、姍姍來遲的重要貢獻”。
而《《自然—試驗流程》》審稿人評價，這項研究提出的“生長曲線引導分離”方法非常有趣，為難以培養(yǎng)的古菌分離提供了新的視角。
承磊說，如今，這套方法不僅適用于產(chǎn)甲烷古菌，還能推廣到熱泉、深海、動物腸道等多種缺氧環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)。他們實驗室已經(jīng)從熱泉和油藏等特殊環(huán)境分離了多株難培養(yǎng)微生物。
承磊希望它成為難養(yǎng)厭氧微生物分離的通用策略，還可結(jié)合人工智能和高通量平臺進行微生物的大規(guī)模高效定向分離，幫助科學界“解鎖”更多隱藏在自然界的微生物角色，豐富人們對地球生命的認識，為氣候研究、能源開發(fā)和環(huán)境保護等研究提供新菌種資源。
相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41596-025-01224-x
https://doi.org/10.1016/j.tim.2025.06.006
